Оплодотворение яйцеклеток и культивирование эмбрионов

Экстракорпоральное оплодотворение - это метод лечения бесплодия, при котором оплодотворение яйцеклеклетки и начальные этапы развития эмбриона происходят вне организма женщины.

Показания для лечения бесплодия помощью ЭКО :

1. Отсутствие проходимости маточных труб
2. Различные формы эндометриоза
3. Высокий риск генетических заболевания у ребенка, требующий проведения преимплантационной генетической диагностики эмбриона перед его переносом
4. Высокий риск хромосомной патологии плода, ассоциированный со старшим репродуктивным возрастом родителей (страше 35 лет)
5. Мужское бесплодие
6. Эндокринное бесплодие.

Протокол ЭКО состоит из целого ряда последовательных этапов:

1. Стимуляция суперовуляции/ мониторинг роста фолликула в естественном цикле
2. Трансвагинальная пункция фолликулов. Этап извлечения яйцеклеток из яичников женщины.
3. Проведение опдлодотворения яйцеклеток сперматозоидами партнера/донора спермы
4. Культивирование эмбрионов
5. Перенос эмбрионов
6. Возможно проведение криоконсервации эмбрионов с целью отсроченного переноса, например, после получения результатов преимплантационной генетической диагностики, или проведения программы отсроченного материнства, программы сохранения фертильности, когда перенос эмбринов может быть проведен спустя месяцы или годы после получения эмбрионов.

Гаметы (ооциты и сперматозоиды) получают от биологических родителей или из банка доноров. Яйцеклетки извлекают из яичников женщины методом пункции фолликулов в ходе их естественного созревания. Но, как правило, в программах ВРТ используют медикаментозное стимулирование для получения достаточного количества ооцитов. Оплодотворение происходит в лабораторных условиях под контролем специалистов. В некоторых протоколах даже слияние сперматозоида и яйцеклетки контролируется эмбриологом (ICSI). После in vitro оплодотворения зиготы переносят в специальную, обогащенную альбумином, питательную среду для нормального предимплантационного развития эмбрионов. Процесс выращивания эмбриона в условиях in vitro называют культивированием.

В каких условиях культивируют эмбрионы

Ключевым моментом эмбриологического этапа программы ЭКО для предимплантационных эмбрионов человека, развивающихся in vitro, является создание максимально приближенных условий к условиям in vivo.

Эмбрионы культивируются в инкубаторах. Обязательными условиями для in vitro культивирования эмбрионов являются:

• температура 37 градусов Цельсия;
• рН культуральной среды, стабильность которой обеспечивается слоем минерального масла сверху культуральной среды и концентрацией СО2
• определенное содержание углекислого газа (5,5%-6.0% в зависимости от выбранной культуральной среды), азота и кислорода (не более 5%).

В инкубаторе находятся яйцеклетки перед оплодотворением, полученные в результате пункции фолликулов или после разморозки ооцитов. Все процессы, включая оплодотворение, дробление, бластуляция также проходят в условиях инкубатора.

Как долго эмбрионы культивируются в инкубаторе

После оплодотворения культивирование эмбрионов может продолжаться в условиях in vitro до 5-6 дней. Продолжительность зависит от нескольких факторов:

• количество полученных ооцитов/эмбрионов;
• возраст и состояние здоровья пациента/реципиента;
• необходимость проведения ПГТ-А, ПГТ-М

Если получено и оплодотворено небольшое количество яйцеклеток (1-2), то перенос можно проводить на третий день развития эмбрионов. Женщинам, у которых в анамнезе уже есть 1-2 попытки ЭКО и есть достаточное количество эмбрионов, чтобы выбрать лучший эмбрион для переноса в полость матки, рекомендуется подсаживать эмбрионы на пятый день развития. Если предполагается проведение предимплантационного генетического тестирования (ПГТ), то эмбрионы культивируются до 5-6 суток с целью проведения биопсии трофэктодермы на стадии бластоцисты.

Какие среды используются для культивирования эмбрионов

От культуральной среды зависит правильное развитие и продолжительность культитвирования эмбрионов. Чаще всего используют 2 типа сред:

• двух-шаговая культуральная среда (sequential medium): используется с 1-3 день с заменой среды на 3-5 день культивирования:
• в состав среды для культивирования с 1-го по 3-й день развития входят аминокислоты, белки, витамины, лактат кальция. Среда имеет определенный состав и уровень pH, который обеспечивает правильное развитие эмбриона на ранних стадиях дробления;
• для пролонгированного культивирования с 3-го до 5-6-го дня используют среды с глюкозой, аминокислотами, таурином, комплексом витаминов, альбумином. Состав элементов поддерживает рост и развитие эмбриона до стадии бластоцисты, максимально укрепляет его, обеспечивает высокую жизнеспособность и готовность к имплантации.
• универсальные, одношаговые среды (one step medium), подходящие для культивирования с 1-5 день развития эмбрионов без замены среды.

Этапы роста и развития эмбриона в процессе культивации

После оплодотворения зигота проходит ряд изменений, свидетельствующих о правильном развитии:

• на следующий день после оплодотворения клетка исследуется на наличие пронуклеусов - клеточных ядер родительских гамет. Наличие двух пронуклеусов (2PN) -нормальное оплодотоворение. Зиготы с нормальным оплодотворением отбираются и культивируются дальше. Если пронуклеусы не просматриваются под микроскопом, яйцеклетка считается не оплодотворенной (0PN). Аномальным оплодотворением считается наличие 3-х (ЗPN) и более пронуклеусов. Яйцеклетки не оплодотворенные и с анамальным оплодотворением не культивируются.
• во второй день развития эмбрион проходит 2 последовательных митотических деления дробления и, в норме, имеет 4 бластомера расположенных в форме тетраэдра, равных по размеру, одноядерных, без фрагментации (Grade 1) (по классификации 4A (цифра 4 обозначает количество бластомеров, буква А -бластомеры хорошего качества ), (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011)
• для 3-го дня развития оптимальным считается 8-клеточный эмбрион с равными по размеру, одноядерными бластомерами, без фрагментации. По международной классификации обозначение 8А (Grade 1)
• на четвертый день эмбрион формирует морулу, состоит из 12- 16 плотно прилегающих друг к другу бластомеров, начинается первая клеточная дифференциация: наружные клетки морулы в дальнейшем будут формировать трофэктодерму (ТЭ), внутренние клетки-внутреннюю клеточную массу (ВКМ) При естественной беременности на этой стадии происходит мигрирование морулы из маточных труб в матку.
• на пятый и шестой день предимплантационного развития эмбриона формируется бластоцита - сфера с внутренней полостью (бластоцель), выстланная рядом клеток трофэктодермы (трофобласт, из которого в дальнейшем формируются различные экстраэмбриональные структуры) и компактная группа клеток внутренней клеточной массы (эмбриобласт- клетки самого зародыша). Перенос бластоциты высокоэффективен, каждая вторая подсадка заканчивается беременностью.

Дольше 6-7 дней эмбрионы не культивируют, их необходимо либо перенести в полость матки реципиента, либо подвергнуть криоконсервации.

Что такое протокол культивирования эмбрионов

Протокол культивирования - это документ, в котором эмбриолог отражает все стадии развития эмбрионов по дням. В протоколе культивирования указываются генетические родители (пациенты/доноры) и реципиенты (пациенты/суррогатная мать). Отмечается количество полученных в результате пункции ооцитов, их зрелость, наличие отклонений цитоплазмы и оболочки ооцитов, а также заносится спермограмма. Далее вносятся результаты оплодотворения и культивирования, морфологические характеристики каждого эмбриона, фиксируются эмбрионы которым проведена биопсия, сделан перенос в полость матки или проведена криоконсервация, отмечаются условия культивирования, какие среды были использованы.

В МЦРМ эмбриологи действуют по четко прописанным протоколам/алгоритмам. . Алгоритмы отработаны, прописаны в СОП (Стандартное Описание Процедуры), что исключает возможность какой-либо ошибки. На каждом этапе работы эмбриолога с биологическим материалом пациентов существует «контроль качества», соответствующий строгим международным критериям. Эмбриологи нашего центра работают в лаборатории, построенной по специальному проекту, оснащенной новым современным оборудованием, с использованием качественных культуральных сред и вспомогательных материалов, используя в своей практике современные методы и эффективные разработки, позволяющие достичь высоких результатов.